Di truyền

Di truyền phân tử 9 – determine the gene sequence

Trong di truyền cổ điển, Mendel mô tả gene là một đơn vị di truyền rời rạc có ảnh hưởng đến tính trạng biểu hiện ra bên ngoài (visible trait hay phenotype). Sau này BeadleTatum định nghĩa lại một gene là một thành phần chứa thông tin hướng dẫn để tạo ra một enzyme (là loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào). Tuy nhiên, định nghĩa này vẫn chưa hoàn chỉnh. Trong di truyền học hiện đại, quan niệm về gene rõ ràng hơn: đó là một đoạn (segment) trong chuỗi DNA nhằm mã hóa cho một protein, và được bắt đầu bằng một “start” codon (AUG) và kết thúc bằng một “stop” codon (UAG, UGG, hoặc UGA).

Các kĩ thuật phân tích gene đã cho phép con người có những bước tiến lớn trong việc xác định trình tự các chuỗi nucleotides tạo thành một gene cụ thể. Và kĩ thuật phổ biến nhất là “chain termination“, do Fred Sanger phát triển (1977) có sử dụng “defective” DNA nucleotide (~ tức là nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất khả năng kết hợp thêm một nucleotide khác tại 3′-end của nó –> chiều dài của chuỗi DNA bị gián đoán, không hoàn chỉnh về chiều dài), tốt hơn phương pháp trước đó là “Maxam-Gilbert sequencing” technology (1975).

Sanger sequencing

Tạo ra “defective” DNA nucleotide:

Đến thập niên 1970, Sanger đưa ra phương pháp để xác định chính xác trình tự chuỗi nucleotides trong một gene. Phương pháp này dựa trên kết quả của Arthur Kornberg về quá trình tự nhân đôi của DNA (DNA replication) - một DNA strand mới được tổng hợp dựa vào thông tin chuỗi từ một DNA template) nhờ vào enzyme DNA polymerase III để kết nối các nucleotide riêng rẽ. Ví dụ DNA template là một poly-thymine DNA, thì DNA strand mới tạo thành sẽ chứa toàn Adenine (theo nguyên tắc bắt cặp (base-pair): A-T, G-C).

Giải thích hình trên: Trong quá trình hình thành chuỗi  DNA mới, phosphate ở đầu C-5′ của deoxynucleotide triphosphate (dNTP), trong trường hợp này là dATP, tự do đi vào sẽ gắn với đầu C-3′ ở cuối chuỗi mới. Tiếp đến, liên kết ester giữa hai nhóm hydroxyl ở 2 chuỗi (strand) sẽ được tạo ra. Theo cách này, chuỗi nucleotides mới sẽ được nối dài dựa trên thông tin của chuỗi nucleotides làm mẫu (template strand). Phương pháp của Sanger mấu chốt ở việc sử dụng dideoxynucleotides triphosphate (didNTP), ở đây là didATP, với đặc tính hóa học riêng biệt. Cũng như dNTP, didNTP được kết hợp vào chuỗi bằng cách hình thành liên kết phosphodiester tại đầu cuối C-5′. Tuy nhiên, didNTP thiếu một nhóm -OH ở đầu C-3′ cần thiết cho việc hình thành liên kết với nucleotide kế tiếp. Điều này có nghĩa là việc thêm nucleotide mới tiếp vào sau vị trí của didNTP sẽ không thực hiện được, xem hình sau. Dựa vào đó, Sanger thiết lập 4 phản ứng diễn ra tại 4 lọ thí nghiệm riêng biệt – từ đó có thể truy ra thông tin về trật tự liên kết của các nucleotides trong template strand. Mỗi lọ phản ứng gồm: 1 template DNA (giống nhau cho cả 4 lọ), 1 primer ngắn (là chuỗi gồm khoảng 20 nucleotides – đề làm “mồi” cho quá trình gắn kết nucleotide vào tiếp – cũng giống nhau cho cả 4 lọ), DNA polymerase III (chất xúc tác cho quá trình tổng hợp nucleotide strand), và hỗn hợp chứa 4 loại dNTPs tự do – dATP, dGTP, dTTP, dCTP – (trong đó một loại được đánh nhãn phóng xạ hoặc được nhuộm màu huỳnh quang tùy vào lọ, ví dụ: lọ 1 thì có dATP được đánh nhãn phóng xạ, lọ 2 thì có dGTP được đánh nhãn phóng xạ). Sau đó, mỗi loại didNTP – A, T, C, hoặc G – được thêm vào mỗi lọ thí nghiệm độc lập ở trên (ví dụ: lọ 1 thì được thêm didNTP Adenine, lọ 2 thì được thêm didNTP Cytosine…). Với các nguyên liệu nêu trên, quá trình tổng hợp ra nucleotide strand mới sẽ được diễn ra trên mỗi lọ. Nó sẽ dừng lại khi có một didNTP được gắn vào. Do đó, chiều dài của DNA strand mới là ngẫu nhiên và dài ngắn khác nhau ở mỗi lọ phản ứng. Nồng độ (concentration) của didNTP được thêm vào thấp hơn rất nhiều so với các dNTP có sẵn –> giúp đảm bảo là DNA strand tạo ra đủ dài. Lưu ý là phân tử DNA tồn tại ở dạng double strands, do đó để có DNA template, ta cần bẻ gãy liên kết hydrogen bonds (giữa 2 strands). Để tách chúng ra, ta nung bằng nhiệt độ, hydrogen bonds sẽ nhanh chóng đứt gãy, primer sẽ có dịp gắn vào DNA template tương ứng với nó (Chú ý là với một primer xác định, chỉ có 1 strand là có thể làm template). Quá trình phản ứng, lấy lọ 1 là nơi có DNA strand mới kết thúc bằng didATP làm ví dụ. Tại lọ 1: Ban đầu, phân tử double-strand DNA tách thành 2 dải riêng biệt tại gần 100độ (near-boiling temperature). Vì ở nhiệt độ cao, chuyển động động học (kinetic motion) của phân tử DNA giúp phá hủy liên kết hydrogen (liên kết yếu) giúp giữ hai DNA strands với nhau. Khi nhiệt độ giảm lại, primer sẽ gắn vào template DNA theo qui luật bắt cặp (base-pairing). Kornberg đã chứng minh rằng primer là cần thiết để DNA polymerase bắt đầu quá trình replication. Phản ứng tạo DNA strand mới sẽ diễn ra tới khi didNTP Adenine gắn vào thì chuỗi không thể dài thêm được nữa. Quá trình tổng hợp sẽ bị ngắt (terminated) và ta có một chuỗi DNA bổ sung (complement DNA strand) với kích thước bị giới hạn, nên ta gọi là  DNA fragments. Như vậy, tùy thuộc vào thời điểm didNTP Adenine gắn vào, DNA fragments thu được sẽ có chiều dài dài ngắn khác nhau. Trong lọ 1, ở hình vẽ dưới, didATP (màu tím), ở các lần TN khác nhau, ta thu được các DNA fragments với các chiều dài khác nhau.

NOTE: DNA polymerase không phân biệt giữa dNTPs và didNTPs. Bên cạnh các nucleotides bình thường là thành phần của DNA fragment, sẽ có các nucleotide được đánh nhãn phóng xạ. CHÚ Ý: Ở hình vẽ trên, tương ứng với lọ 1, các dNTP Adenine luôn được đánh nhãn phóng xạ. Nên với các dNTP Adenine ban đầu, ta phải hiểu là chúng được đánh nhãn phóng xạ. Kết quả cũng tương tự với 3 lọ còn lại (mỗi lọ sẽ có các DNA fragments mới với nucleotides kết thúc chuỗi tương ứng là didCTP, didTTP, và didGTP).

Xác định trình tự DNA template

Trình tự của chuỗi DNA template có thể xác định gián tiếp thông qua trình tự của chuỗi DNA mới tạo thành, dựa trên nguyên lí bổ sung cho nhau.

Sau quá trình tạo ra “defective” DNA fragment, ta sẽ nung nóng ở mỗi lọ phản ứng nhằm tách DNA fragment mới ra khỏi DNA template. Sau đó, DNA fragment sẽ được đưa riêng rẽ vào một môi trường gọi là polyacrylamide gel (mỗi fragment sẽ được phân cách, nằm trên một làn khác nhau, nhờ có chứa urea giúp ngăn các DNA fragments ở hai lọ khác nhau khỏi gắn kết với nhau trong quá trình điện phân (electrophoresis). Quá trình electrophoresis sẽ giúp 4 strands di chuyển từ cực (-) sang cực (+). Các gốc phosphate bị ion hóa (ionized phosphate – ) làm cho các DNA fragments có điện tích âm. Tùy vào số lượng nucleotides trên mỗi DNA fragments, tổng điện tích âm của 4 strands sẽ khác nhau. Tuỳ vào điện tích mỗi strand, chiều dài di chuyển của chúng cũng khác nhau. Vì thế mỗi DNA fragment sẽ dịch chuyển về cực dương của trường điện từ và dừng lại ở các vị trí khác nhau (với độ phân giải đến 1 nucleotide đơn lẻ – nghĩa là 2 DNA fragments chỉ khác nhau về số lượng 1 nucleotides cũng có thể phân biệt được).

NOTE: Ngoài yếu tố điện tích, yếu tố kích thước cũng ảnh hưởng đến việc dịch chuyển của các DNA fragments qua lưới polyacrylamide (polyacrylamide matrix) – DNA fragments có kích thước nhỏ thì dịch chuyển xa, và ngược lại.

Để theo dõi quá trình dịch chuyển của các DNA fragments, một chất nhuộm màu màu xanh được đưa vào – chúng luôn dịch chuyển nhanh hơn một tí so với DNA fragment nhỏ nhất trong hỗn hợp. Qua quá trình electrophoresis, các DNA fragments ngắn hơn thì dịch chuyển nhanh hơn. Các DNA fragments có cùng kích thước sẽ dịch chuyển về cùng 1 vị trí. Kết thúc quá trình electrophoresis, gel matrix sẽ được chiếu lên tia X và chụp hình lại. Điều này giúp nhận dạng các vị trí của các dNTP được đánh nhãn (nổi lên thành các dải màu đen (black band)). Với lọ 1, nhờ vào Adenine được đánh nhãn phóng xạ tồn tại trong DNA, nó sẽ phát ra hạt beta hiển thị lên phim và cho ta thấy vị trí của các DNA “band” đó trong gel. Tương tự với DNA bands từ các lọ còn lại. Vì đã biết là DNA fragment từ lọ nào nằm ở vi trí nào, nên ta có thể biết là DNA fragment đó có chứa dATP nào được đánh nhãn phóng xạ. Như vậy nếu ở cột 1, có band được hiển thị, thì ta biết đó là dATP được đánh nhãn phóng xạ, và vì cả 3 DNA fragments còn lại cùng với DNA ở cột 1 cũng từ 1 DNA template tạo ra và khởi đầu tại cùng 1 nucleotide, nên chắc chắn là nucleotide ở hàng tương ứng với band được hiển thị đó cũng là dATP (chỉ khác là dATP này không được đánh nhãn phóng xạ nên không nhìn thấy). Dựa vào đó, ta có thể đọc (đi từ dưới lên) để nắm được trình tự nucleotides ở 4 cột dựa vào band ở cột nào mà có đánh nhãn phóng xạ để suy ra nucleotide ở các cột còn lại. Hình ảnh sau sẽ cho ta cái nhìn cụ thể hơn khi mà mỗi band sẽ có ddATP được nhuộm màu khác nhau.

Automated sequencing machine

Công việc xác định trình tự từ các band này rất cần được tự động hóa, và thế là các “automated” sequencing machine ra đời. Vì mỗi chất nhuộm màu có một bước sóng riêng, các máy này sẽ dùng tia laser để xác định bước sóng để từ đó định ra nucleotide tương ứng, và hình ảnh về các đỉnh (peak) của 4 loại bước sóng khác nhau được hiển thị như trong hình vẽ sau (còn gọi là chromatogram – Greek: chromo = color, gram = writing). Mỗi loại nucleotide tương ứng với các peak có độ cao khác nhau. Phương pháp Sanger cho ta mỗi đoạn ngắn (gọi là “read”, “segment”, “fragment”) trong khoảng 500-1000pbs. Và các máy tự động đọc chiều dài của fragment mỗi lần là khoảng 200-500 bps (base pairs) và gần đây là 900 bps.

TEST

1. Để kiểm tra cách đọc, ta có thể dựa vào hình vẽ bên và cho biết chuỗi nucleotide nào trong 4 lựa chọn trên là đúng với chuỗi 20 nucleotides đầu tiên của DNA fragment.

2. Kết quả thu được là trình tự đọc theo chiều 5′ –> 3′ của DNA fragment, vậy, trình từ 3′ –> 5′ của complement DNA template là gì? 3. Nếu mRNA được tổng hợp từ complement DNA template này theo chiều 3′–>5′, vậy chuỗi nucleotide của mRNA theo chiều 5′–>3′ là gì?

NOTE: Fred Sanger cũng là người đầu tiên xác định được trình tự amino acids trong một protein (1950s). Đó là insulin protein với 51 amino acids. Tuy nhiên, điều này không cho phép ta xác định được trình tự của nucleotides mã hóa cho insulin protein (lí do đã đề cập trong phần trước – nhiều codons có thể mã hóa cho cùng một nucleotide).

Next-generation sequencing technology

Hiện nay, người ta thường nhắc đến một kĩ thuật mới giúp tăng khả năng xác định trình tự lên high throughput, và chi phí thấp gọi là “next-generation sequencing technology” với chiều dài các “reads” ngắn hơn, gọi là “short-reads”, vào khoảng 80-100bps thậm chí 20-30bps.

TERMS

  • gene: tại thời điểm này, quan điểm về gene đã được cập nhật, đó là một phân đoạn trong chuỗi vô cùng lớn DNA. Gene mã hóa cho một protein. Đơn vị cấu trúc của protein là nucleic acid (ta đã đề cập). Ta biết là có 20 loại nucleic acids đóng vai trò cấu thành một protein (CHÚ Ý: nếu không bắt buộc là đơn vị cấu thành ban đầu một protein, thì số lượng nucleic acids rất nhiều – khoảng 100). Gene gồm các nucleotides (có 4 loại nucleotides, trong RNA thì kí hiệu là  A, U, G, C – ta đã tìm hiểu trong phần central dogma), nên cứ mỗi bộ 3 nucleotides sẽ mã hóa cho một nucleic acids (xem phần DNA words). Ta gọi bộ ba này là một codon. Condon đánh dấu bắt đầu một gene là “start” codon: AUG, và codon đánh dấu kết thúc một gene là “stop” codon (có 3 lựa chọn): UAG, UGG, UGA.
  • electrophoresis: là kĩ thuật phân tách các phân tử dựa vào tính chất vật lí là khối lượng, kích thước, và đích tích của chúng.
  • chromatogram: sắc phổ kí

SUMMARY:

LINKS:

  1. http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1977_Gilbert.php
  2. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing
  3. http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Obenrader/sanger_method_page.htm

ANSWER: 1. Chuỗi thứ nhì.

Một số hình ảnh minh hoạ cho chromatogram

Di truyền phân tử 7 – DNA –> RNA –> protein (central dogma)

Đây là hình ảnh cắt lát của tế bào. Nhìn tổng thể, đó là một bộ máy phức tạp với nhiều cơ quan có màng bao bọc. Các bộ máy này hoạt động đồng bộ với nhau để giúp cho tế bào hoàn thành chức năng sống.

DNA chứa genes tồn tại trong nhân tế bào (nucleus). Tuy nhiên, quá trình tổng hợp ra protein được mã hoá bởi genes lại được diễn ra riêng biệt trong tế bào chất (cytoplasm) mà cụ thể là tại ribosome - nằm ngoài nhân. Vậy câu hỏi đặt ra là “làm cách nào gene, là một phần của DNA nằm, trong nhân tế bào có thể giúp cho quá trình tổng hợp protein nằm ngoài nhân?“.

Để trả lời, Francis Crick đã đề xuất khái niệm “Central Dogma” -theo đó thông tin di truyền được truyền 1 chiều: nghĩa là từ phân tử  DNA thông tin được mã hoá sang mRNA rồi phân tử mRNA được vận chuyển ra ngoài nhân, tại đó thông tin được giải mã để sản xuất ra protein tương ứng. mRNA đóng vai trò là một loại phân tử truyền tải (carrier molecule). Và ông cho rằng ứng cử viên cho chức năng truyền tải đó là RNA được tìm thấy ở khắp cytoplasm của tế bào – mà sau này Sydney Brenner, Francois Jacob, và Matthew Meselson xác định sự tồn tại của carrier molecule này và đặt tên là mRNA (messenger RNA).

RNA là ribose nucleic acid được tìm thấy chủ yếu trong cytoplasm. RNA cũng có backbone là sugar-phosphate như phân tử DNA. Điểm khác biệt đầu tiên là RNA dùng đường ribose, còn DNA dùng đường deoxyribose (nhóm -OH tại C2′ được thay bởi -H).

Điểm khác biệt thứ 2 là DNA có các base A, T, G, C còn RNA đi với các base A, U, G, C (Thymine thay bằng Uracil). Tương ứng, ta có qui luật bắt cặp cho RNA là A-U, G-C qua hydrobonds.Điểm khác biệt thứ 3 và cuối cùng đó là, DNA phần lớn thời gian tồn tại ở dạng phân tử kép (double-strand molecule) còn RNA là phân tử đơn (single-strand molecule).

“Old” Central Dogma

Như vậy, ‘central dogma’ theo quan điểm của Watson-Crick là  thông tin truyền từ DNA–> RNA–> protein. Tới đây Crick nhận thấy một vấn đề là làm sao các amino acids tự do có thể liên kết với carrier RNA (mRNA)? Và ông đưa ra giả thuyết là tồn tại các phân tử làm vai trò cầu nối (adaptor molecule) tuy nhiên ông chưa có câu trả lời. Và thực tế là có tới 20 adaptors (sau này do Zamenik tìm ra đã khẳng định tính đúng đắn của giả thuyết của Crick, và nó được đặt tên là tRNA – transfer RNA) khác nhau, mỗi cái sẽ gắn với mỗi loại amino acid để đem chúng đến ribosome là nơi tổng hợp ra protein.

central_dogma_old

Tóm gọn lại central dogma là như sau:

  • một đoạn DNA tương ứng với một gene sẽ làm template để tạo ra bản sao mRNA, quá trình này gồm nhiều giai đoạn sẽ được đề cập ở một bài riêng. Một enzyme, gọi là RNA polymerase, đóng vai trò tổng hợp ra mRNA  từ DNA template.
  • mRNA (mang thông tin di truyền) sẽ di chuyển ra ngoài nhân (sang tế bào chất) đến gần ribosome là bộ máy tổng hợp protein. Cứ mỗi bộ ba residues trên mRNA sẽ mã hoá cho một amino acids.
  • tRNA đóng vai trò làm adaptor để đọc thông tin các bộ ba trong mRNA để mang các amino acids tương ứng sang ribosomes nhằm tổng hợp protein.

“New” Central Dogma

central_dogma_newGần đây, với sự khám phá ra microRNA (miRNA) đã thay đổi quan điểm truyền thống về central dogma.

miRNA cũng được tổng hợp như mRNA. Tuy nhiên, thay vì được dịch mã (translated) như mRNA để tổng hợp ra protein, miRNA lại tự uốn lại (fold)  để tạo ra một cấu trúc lặp vòng. Lúc đó, miRNA có thể nhắm đến một một mRNA cụ thể và ngăn cản mRNA nó được dịch mã, hay có thể huỷ hoại (degrade) mRNA đó.  Các nghiên cứu gần đây cho thấy vai trò cực kì quan trọng của miRNA trong quá trình phát triển của cơ thể vì nó giúp ngăn ngừa biểu hiện một số gene (gene expression) do những sai sót của quá trình gọi là “leaky transcription“.

PHỤ LỤC1:

Bước 1: từ 1 chuỗi DNA template, RNA polymerase sẽ giúp tổng hợp ra mRNA chứa thông tin di truyền của DNA đó theo qui luật bổ sung

| DNA : mRNA

| A – U

| T – A

| G – C

| C – G

Như vậy, theo qui luật bổ sung (complementary rule), mRNA sẽ là bản sao thông tin di truyền của DNA, mọi thay đổi (mutation) của DNA (nếu có) sẽ được thể hiện trong mRNA. CHÚ Ý: tRNA không chứa thông tin di truyền, nên tRNA không có thay đổi.

Bước 2: mRNA đi ra khỏi nucleus, đến ribosome, tại đó 2 subunits của ribosome sẽ ghép lại và gắn chặt mRNA lại để bắt đầu quá trình tổng hợp proteins. Chú ý là để tổng hợp ra một protein cần các amino acids tự do, các amino acids này sẽ được tRNA đem đến, trật tự liên kết các amino acids này được qui định bởi trật tự các nucleotides bên trong mRNA. rRNA là một thành phần bên trong ribosomes cũng đóng vai trò giúp tổng hợp protein nhưng chức năng cụ thể thì chưa biết rõ.

PHỤ LỤC2:

Xác định ra tRNA

Paul Zamecnik là nhà khoa học nghiên cứu về tổng hợp protein (protein synthesis). Vào thập niên 1950, ông chưa biết về giả thuyết “Central Dogma” và adaptors của Crick. Ông đã tiến hành tổng hợp protein và tiếp cận theo quan điểm sinh hóa (dùng các hợp chất để tổng hợp ra protein). Bằng cách chiết xuất từ tế bào gan của chuột (đó là một dung dịch nước có chứa mọi thành phần từ việc nuôi cấy tế bào). Năm 1953, ông đã chứng minh có thể tổng hợp ra protein từ chiết xuất này trong môi trường ống nghiệm.

Để chứng minh sự tồn tại của các polypeptides, ông cho thêm một loại amino acid có đánh nhãn phóng xạ (radiolabeled) - C14 leucine - vào trong dung dịch. Ông ủ dung dịch (incubate) ở nhiệt độ cơ thể rồi đem vào máy li tâm (centrifuge). Chuỗi (radiolabelled) polypeptide được tạo thành, có chứa các radiolabelled amino acids, nặng hơn và chìm xuống dưới. Còn các amino acids rời, sẽ vẫn nổi ở trên (supernatant).

Ở dưới đáy, trộn lẫn với các radiolabelled polypeptide, Zamecnik còn phát hiện một cấu trúc tế bào khá lớn – mà sau này xác định là ribosome. Ribosome là thành phần tế bào bên trong tế bào chất (cytoplasmic organelle) nơi việc tổng hợp protein xảy ra. Ribosomes được tạo thành từ RNA và proteins. RNA thuộc ribosomes được gọi là rRNA (ribosome RNA) và nó tham gia vào quá trình tổng hợp protein (như đã nói ở trên), nhưng vai trò cụ thể của rRNA lúc đó vẫn chưa được biết.

Mahlon Hoagland, một thành viên trong Lab của Zamecnik, còn phát hiện ra một loại RNA khác - aminoacyltRNA synthetases – trong phần dung dịch của tế bào – nó nhằm hoạt hóa, cung cấp năng lượng cho các amino acids trước khi các amino acids này có thể tham gia vào quá trình hình thành proteins.

Sau đó, năm 1955, Zamenick, Mary StephensenHoagland phát hiện rằng các amino acids sau khi được hoạt hóa sẽ phải gắn vơí một phân tử RNA có trọng lượng thấp (low molecular weight soluble RNA) rồi từ đó mới được đưa đến ribosomes để tổng hợp ra proteins.

Jim Watson, khi ghé thăm lab, đã phát hiện RNA có thể hòa tan trong tế bào chất (soluble RNA) giống với giả thuyết về adaptor của Crick. Mỗi soluble RNA bắt cặp với một đối tác amino acid và đưa amino acid này đến ribosome để tổng hợp ra protein. Soluble RNA sau này được đổi tên lại là tRNA (transfer RNA)

PHỤ LỤC3:

Phát hiện ra mRNA (messenger RNA)

Tới thời điểm này, ta biết cách thức các amino acids được thu thập để có thể liên kết tạo thành proteins. Nhưng trật tự liên kết của các amino acids đó như thế nào? Điều này đã được mã hóa trong gene. Và câu hỏi là genetic code từ DNA được truyền đến ribosome như thế nào?

  • rRNA không phải là ‘template’ để giúp xác định cấu trúc protein (được chứng thực bởi Sydney Brenner, Francois Jacob, và Matthew Meselson)

Họ xác định có một loại RNA thứ 3 (hai RNA đã đề cập là rRNA và tRNA) – một sản phẩm trung gian không tồn tại lâu dài – mang genetic code từ DNA tới ribosome. Để kiểm chứng, họ sử dụng vi khuẩn bị nhiễm phage (phage-infected bacteria) được tạo thành bằng cách: (1) cho vi khuẩn phát triển trong môi trường có đồng vị nặng (heavy isotopes) của carbon và nitrogen (C13N15) để đánh nhãn phóng xạ mọi RNA và protein của vi khuẩn. (2) Sau đó, cho vi khuẩn vào với phage, sau đó chuyển ngay vi khuẩn bị nhiễm phage sang môi trường thiếu đồng vị nặng nhưng vẫn chứa phóng xa (radioactive) P32.

Trước khi phân tách vi khuẩn, họ cho dừng sự phát triển của phage. Và rồi trích xuất RNA và ribosomes ra khỏi vi khuẩn. Đưa phần trích xuất vào máy li tâm có density gradient (mật độ thay đổi) sẽ giúp tách rời nhiều thành phần để giúp phân tích sự phân bố của các đồng vị nặng và nhẹ trong ribosomes, cùng với việc tích hợp của P32 vào trong phage RNA mới tạo ra.

Và ông xác định tồn tại một loại RNA mới được hình thành, do có chứa P32, chính là nơi chứa thông tin di truyền. Và RNA này được gọi là mRNA (messenger RNA).

*** Làm cách nào để mỗi tRNA nhận biết amino acid tương ứng với nó?

PHỤ LỤC4:

Phát hiện ra miRNA (micro RNA)

miRNA (μRNA) là một non-coding RNA (vì nó không dùng để dịch mã thành protein) và đóng vai trò điều chỉnh gene expression. miRNA có chiều dài rất ngắn (21-23 nucleotides) và trước đây chỉ được xem là một “junk” RNA (nghĩa là không có vai trò gì cả). miRNA đầu tiên được tìm ra có tên là lin-4 do Victor Ambros và các đồng nghiệp Rosalind Lee và Rhonda Feinbaum tại Đại học Harvard trong khi đang nghiên cứu sự phát triển của giun (nematode) Caenorhabditis elegans có đột biến.

Sự ra đời của miRNA cho thấy RNA không chỉ làm duy nhất công việc tạo ra protein. Mục đích chính của miRNA là giảm biểu hiện gien (down regulate gene expression). Có nhiều loại miRNA đóng vai trò này. Người ta dự đoán có khoảng 1000 miRNA trong con người, và khoảng 500 trong chúng đã được nhận diện. Thông tin về nó có thể truy cập ở:

  1. http://www.mirbase.org/
  2. http://www.microrna.org/microrna/home.do

Sự tìm thấy miRNA đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thuốc (drug development).

TERM:

  • point mutation: đột biến xảy ra tại 1 vị trí của nucleotide trong DNA mà tại đó 1 nucleotide được thay thế bằng 1 nucleotide khác
  • deletion: đột biến xảy ra tại 1 vị trí của nucleotide trong DNA mà tại đó một nucleotide nào đó bị mất đi khỏi DNA
  • Protein: là một chuỗi polypeptide các amino acids được liên kết bằng peptide bonds.
  • leucine: là một trong 8 essential amino acids.
  • phage (hay bacteriophage): là một loại virus sống kí sinh trên vi khuẩn (bacteria), và nó có thể làm chết vi khuẩn
  • polymerase: là một loại enzyme làm nhiệm vụ kết nối các nucleotides lại với nhau dựa trên một chuỗi DNA có sẵn (template). Có 2 loại enzyme polymerase: DNA polymerase RNA polymerase
  • Ribosome là “protein builder” hay “protein synthesizers” của tế bào. Nó có tác dụng kết nối các amino acids rời rạc lại với nhau thành chuỗi polypeptides. Một ribosome không phải chỉ là một piece, nó có 2 phần (pieces hay subunits). Các nhà khoa học gọi 2 đơn vị con này là 60-S (large) và 40-S (small). Hai đơn vị con này chỉ ghép lại, và kết hợp với mRNA, khi cần tạo ra protein. Mô hình 60-S/40-S dùng với eukaryotic cell, còn với prokaryotic cell thì nó là mô hình 50-S/30-S.

SUMMARY:

Central Dogma (luận thuyết trung tâm) là quan điểm cho biết đường đi (pathway) của thông tin di truyền qua đó giúp ta hiểu được quá trình di truyền được diễn ra như thế nào. Việc ra đời và hoàn chỉnh luận thuyết trải qua một thời gian với sự khám phá ra các loại RNA khác nhau (mRNA, miRNA, tRNA, rRNA) tham gia vào quá trình điều tiết biểu hiện gien (gene expression)

References:

  1. http://www.chem4kids.com/files/bio_aminoacid.html (amino acids)
  2. http://www.thenakedscientists.com/forum/index.php?topic=3217.0;prev_next=next (how many amino acids exist?)
  3. http://en.wikipedia.org/wiki/Leucine (leucine amino acid)
  4. http://www.biology4kids.com/files/cell_ribos.html (ribosome)
  5. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V (1993). “The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14″. Cell 75 (5): 843–854.
  6. http://www.pharmaprojects.com/therapy_analysis/microRNA-0808.html

BỔ SUNG:

  1. Transcription
  2. Translation

Di truyền phân tử 6 – half of the DNA is a template to create the whole DNA

Tại thời điểm này, ta đã biết DNA là cấu trúc xoắn kép, xoắn theo chiều tay phải (B-DNA). B-DNA tạo bởi các monomer là A, T, G, C kết nối theo chiều 5′-3′. DNA nằm trong nhân tế bào và chứa thông tin di truyền (các genes). Câu hỏi đặt ra là: trong quá trình phân bào (mitosis), làm sao để nhân đôi thông tin di truyền để 2 tế bào con đều có cùng thông tin di truyền? -  Dựa vào mỗi quan hệ ghép cặp (A-T, G-C), Watson và Crick đã đưa ra giả thuyết là “mỗi chuỗi trong phân tử DNA đóng vai trò làm mẫu (template) để tạo ra phân tử DNA hoàn chỉnh”.

Năm 1958, có 2 bằng chứng giúp chứng minh giả thuyết này:

  • Phát hiện ra một loại enzyme giúp tổng hợp các nucleotide bổ sung để ghép cặp với các nucleotide ở chuỗi DNA template, gọi là DNA polymerase.
  • Vì mỗi nucleotide có bazơ chứa nỉtogen, một thí nghiệm dùng các đồng vị phóng xa nặng của nitrogen (N15) để theo dõi qúa trình phân chia của DNA đã cho thấy mỗi nửa của phân tử DNA “không thay đổi” và đi về mỗi tế bào con. Chính sự bảo toàn “không thay đổi” này, giúp cho mỗi nữa này có thể tái tạo ra phân tử DNA hoàn chỉnh, nhờ sự trợ giúp của DNA polymerase, và giống với phân tử DNA nguyên gốc từ tế bào mẹ. Cái này được gọi là quá trình nhân đôi bán bảo toàn (semi-conservation replication), do mỗi tế bào con chứa một nửa của phân tử DNA gốc.

DNA_duplicate

Matthew Meselson và Frank Stahl đã chứng minh được rằng phân tử DNA mới là được tạo thành tử phân tử DNA gốc. Họ dùng E.Coli, nuôi cấy trong 3 môi trường:

  1. môi trường 1: chỉ có N15, sau khi E.Coli nhân đôi, N15 được gắn vào các nitrogenous base (A, T, G, C).
  2. môi trường 2: có N15, sau đó nuôi cấy tiếp trong môi trường có N14 (là nitrogen tự nhiên)
  3. môi trường 3: chỉ có N14

Matthew_Stahl_expr

Sau đó, họ thu thành 4 mẫu.

  1. Mẫu 1 là từ môi trường 1, với thời gian đủ 1 lần phân bào.
  2. Mẫu 2 là từ môi trường 2, với thời gian đủ 1 lần phân bào
  3. Mẫu 3 là từ môi trường 2, với thời gian đủ 2 lần phân bào
  4. Mẫu 4 là từ môi trường 3, với thời gian đủ 1 lần phân bào

Tiếp đến, họ kiểm tra thành phần nitrogen trong mỗi mẫu. Để làm vậy, họ tách DNA mỗi mẫu ra và cho vào trong môi trường muối có hàm lượng cao (strong salt solution). Sau đó, họ dùng may li tâm cho các mẫu với tốc độ cao. Lực li tâm sẽ làm các phân tử nặng hơn chìm xuống đáy. Các phân tử nhẹ hơn sẽ nổi ở phíả trên; tạo ra một môi trường có độ muối thay đổi từ dưới lên trên (salt gradient). Kết quả cho thấy, các phân tử ở mẫu 1, do có N15, nên nặng hơn, và chìm sâu hơn các phân tử DNA chỉ có chứa N14, ở mẫu 4. Ở mẫu 2, khi mà phân tử DNA vửa ở trong môi trường có N15 và rồi N14, các phân tử DNA chìm ở mức giữa so với DNA ở mẫu 1 và mẫu 4. Ở mẫu 3, với thời gian ở môi trường N14 gấp đôi, so với mẫu 2, họ quan sát thấy có 2 dải DNA

Matthew_Stahl_expr3

Giải thích:

  1. Mẫu 1: phân tử DNA con tạo ra dùng N15 nên nặng nhất
  2. Mẫu 4: phân tử DNA con tạo ra dùng N14 nên nhẹ nhất
  3. Mẫu 2: phân tử DNA con tạo ra dùng N15. Sau trong môi trường N14, các phân tử DNA con có một nửa của mẹ (chuỗi DNA có N15), và một nửa là chuỗi DNA mới tổng hợp (chỉ có N14) – hybrid molecule. Nên trọng lượng của nó ở lưng chừng so với mẫu 1 và 4
  4. Mẫu 3: phân tử DNA từ mẫu 2, sau khi tiếp tục ở lâu trong môi trường có N14, tiếp tục nhân đôi và lớp các phân tử DNA con được tạo ra từ phân tử mẹ có 1 chuỗi DNA chứa N15 và chuỗi DNA chứa N14. Nên mẫu 3 chửa cả các phân tử DNA chỉ toàn N14, và các phân tử DNA có cả N14 + N15. Kết quả là tạo ra 2 band DNA như hình vẽ.

Tuy nhiên, việc dự đoán về tính bản bảo toàn có thể được xác nhận. Nhưng cơ chế nhân đôi như thế nào, thì vẫn là một ẩn số vào lúc đó. Câu trả lời phải nhờ đến Athur Kornberg. Ông đã chiết xuẩt ra được một enzyme mà ông gọi là DNA polymerase và đưa vào trong môi trường muối, có DNA và các nucleotides cần thiết (A, T, G, C). Mục đích của ông là kiểm tra khả năng nhân đôi của DNA trong môi trường phi tế bào (cell-free system). Ông dùng Thymine (T) đã được đánh dấu phóng xạ (radioactive label) để theo dõi các DNA mới được tạo ra.

Konberg_expr2

Konberg_expr3

Sau khi nuôi cấy ở môi trường nhiệt độ cơ thể (37C), ông quan sát thấy các Thymine được đánh nhãn phóng xạ cùng các nucleotide khác đã tham gia vào quá trình tổng hợp nên các phân tử DNA mới. Đồng thời, khi thử loại bỏ một loại nucleotide ra, ông cũng kết luận rằng, nếu thiếu một trong 4 loại nucleotides, quá trình nhân đôi cũng không thể xảy ra. Khi thử cho DNase, một enzyme đóng vai trò làm đứt gãy chuỗi DNA, vào trong môi trường, thì quá trình nhân đôi cũng không xảy ra. Ông kết luận là quá trình replication cần một template DNA.

Sau này, các nhà khoa học khám ra ra rằng có hơn một loại DNA polymerase. Loại enzyme mà Kornberg khám phá ra, gọi là DNA polymerase I – đóng vai trò chính trong việc sửa chửa DNA. DNA polymerase III – được tìm thấy bởi Tom, con trai của Kornberg, mới đóng vai trò trong việc nhân đôi của DNA trong E.Coli. Loại còn lại, DNA polymerase II (DNA Pol II hay Pol II) là một prokaryotic DNA polymerase đóng vai trò trong việc sửa chửa DNA cho prokaryotes.

TERM:

  • DNA polymerase: là một enzyme đóng vai trò (1) sửa chữa DNA (DNA polymerase III), (2) đóng vai trò sửa chửa DNA (DNA polymerase I, DNA polymerase II)
  • DNA template: một trong 2 chuỗi của phân tử DNA, khi nó đóng vai trò làm mẫu cho quá trình tạo ra phân tử DNA con hoàn chỉnh

SUMMARY:

Quá trình nhân đôi DNA là quá trình semi-conservation replication. Nó cần sự hỗ trợ của một enzyme gọi là DNA polymerase. Có 3 loại DNA polymerase. Các nucleotides tự do trong tế bào, sẽ tham gia vào quá trình hình thành hai chuỗi DNA bổ sung vào 2 chuỗi DNA template.

References:

  1. http://www.dnaftb.org/dnaftb/20/concept/index.html

Di truyền phân tử 5 – "discover the secret of life" DNA shape

Trong các phần trước, ta đã biết phân tử DNA là nơi lưu giữ thông tin di truyền (nghĩa là chứa genes). DNA là một polymer, được tạo bởi các monomer là các nucleotides. Có 4 loại nucleotides: A, T, G, C. Mỗi gene là một đoạn DNA tạo bởi chuỗi các nucleotides nhưng vì chúng quá nhỏ, chưa có một kính hiển vi nào cho phép quan sát cấu trúc thực của một phân tử DNA. Vì thế, không ai biết các đơn phân nucleotides này sẽ kết hợp với nhau như thế nào để có thể mang một lượng lớn thông tin di truyền cần thiết để tạo ra một cá thể sống. Đó được gọi là bí ẩn của cuộc sống (the secret of life). Hay nói một cách chính xác là cấu trúc của DNA vẫn là một ẩn số vào thời điểm đó (1940s-1950s).

Vào thời điểm đó, các mô hình thực nghiệm hay lí thuyết được nhiều nhà khoa học đề ra về cấu trúc của DNA đều không chính xác. Như đã đề cập trong phần trước, dù Levene đã đúng khi cho rằng các nucleotide liên kết theo nguyên tắc đầu 5′ đến 3′ (đường-phosphate-đường-phosphate-…), nhưng quan điểm về lý thuyết “tetranucleotide block” của ông là một sai lầm. Và Chargaff đã chỉnh sửa khiếm khuyết đó với quan điểm số Adenine = số Thymine, số Guanine = số Cytosine (tỉ lệ A = T, G = C).

Vào thời điểm đó, một nhà khoa học khác tên là Linus Pauling dùng một kĩ thuật mới gọi là tinh thể học tia X (X-ray crystallography) để khám phá cấu trúc protein. Hình ảnh thu được từ kĩ thuật này là các mẫu nhiễu xạ (diffraction pattern), và bằng các kĩ thuật tính toán phức tạp nhờ máy tính có thể giúp xây dựng lại cấu trúc 3D của phân tử ở dạng tinh thể. Kết quả thành công thu được cho thấy viễn cảnh có thể dùng kĩ thuật X-ray crystallography để xem xét cấu trúc của DNA. Tuy nhiên, không dựa vào thực nghiệm, WatsonCrick đưa ra những suy luận riêng của mình và xây dựng mô hình cấu trúc phân tử một cách trực quan dùng các que cùng các quả cầu nhỏ (stick-and-ball models) – mỗi quả cầu nhỏ đại diện cho một đơn phân.

stick-and-ball model of DNA structure
(stick-and-ball model)

Cấu trúc protein có dạng xoắn như cái mở nút chai (corkscrew-shaped structure) – hay còn gọi là alpha-helix (xoắn alpha)

Để kiểm chứng cho những suy luận của mình, Francis và Watson cùng dựa vào thông tin từ các mẫu nhiễu xạ để tìm lời giải cho cấu trúc của DNA. Và nhờ may mắn, họ đã có thể kiểm chứng được sự đúng đắn của mô hình đưa ra khi dựa vào hình ảnh các mẫu nhiễu xạ tia X sau khi chiếu vào phân tử DNA ở dạng muối (salt of DNA – thời đó chưa tạo được tinh thể DNA) nhờ vào kĩ thuật X-ray crystallography (Bức ảnh này gốc là do Rosalind Franklin chụp tại King’s College ở London, và Wilkins là người cung cấp cho Watson & Crick).

Vào thời đó, có 2 bức ảnh về mẫu nhiễu xạ của 2 sợi DNA khác nhau, đều do Rosalind Franklin và Maurice Wilkins chụp, xem ở hình sau. Franklin thì tập trung vào bức ảnh đầu do nó có vẻ phức tạp hơn và bà nghĩ nó có nhiều thông tin hơn, trong khi Wilkins thì chọn bức ảnh sau do tính đối xứng đơn giản của nó và bức ảnh này đã được đưa cho Watson & Crick xem để rồi họ đã có thể xác định tính chính xác của mô hình họ đưa ra.

(B form DNA taken by Rosalind Franklin, 1952)

Trong hình ảnh chụp X-ray crystallography, ta thấy một chữ X mờ (fuzzy ‘X’) ở giữa phân tử, đó là mẫu cho thấy cấu trúc xoắn ốc (helical structure). Vì số luợng nucleotides tuân theo tỉ lệ A = T, và G = C, Watson đã có thể đưa ra qui luật bắt cặp (base pairing), nghĩa là A luôn liên kết với T, G liên kết với C. Đồng thời ông còn phát hiện ra một điều quan trọng: chiều dài liên kết A-T bằng chính xác với chiều dài liên kết G-C. Nếu vậy, mỗi bậc thang trong chuỗi xoắn kép sẽ có chiều dài bằng nhau, và bộ khung đường-phosphate sẽ ổn định. Lập luận này càng được củng cố vì mẫu nhiễu xạ rất cân đối, chứng tỏ chiều xoắn ổn định, hay đường kính của ốc xoắn được giữ nguyên.

Nói tóm lại, James Watson và Francis Crick đã thành công với khám phá cấu trúc 3 chiều của một phân tử DNA: đó là chuỗi xoắn kép có dạng hình thang (ladder) cuộn vào nhau theo cùng 1 trục với các bậc thang (rungs of the ladder) chính là liên kết giữa các cặp bazơ chứa nitrogen (base pairing: A-T, G-C) ở 2 chuỗi. Hai đường thân của thang là luân phiên liên kết giữa gốc phosphate và phân tử đưởng deoxyribose theo chiều 5′-3′. Hướng xoắn là hướng đi lên theo qui tắc bàn tay phải (right-hand double helix) nên còn gọi là B-DNA. Một số nhà khoa học quan điểm tồn tại Z-DNA (hay left-hand twisted DNA) nhưng nó rất hiếm và chỉ là “in vivo” (tồn tại trong phòng TN). Tuy nhiên, số lượng bài báo sai lầm khi đề cập đến Z-DNA cũng không phải là ít và Tom Schneider tại NIH đã sưu tầm chúng tại http://www.lecb.ncifcrf.gov/~toms/LeftHanded.DNA.html.

Cấu trúc B-DNA

Cấu trúc B-DNA

James Watson và Francis Crick công bố kết quả trên Nature, chỉ nêu ra suy luận và không có bằng chứng thực nghiệm nào cả. Đồng thời, không có lời cảm ơn nào đối với Franklin và Wilkins ngoại trừ câu: “We have also been stimulated by a knowledge of the general nature of the unpublished results and ideas of Dr. M.H.F. Wilkins, Dr. R.E. Franklin, and their co-workers at King’s College London“. Frankiln chết do bệnh ung thư năm 1958, nên chỉ có 3 người nhận giải Nobel vào năm 1962 vì họ không trao cho người đã chết (posthumously).

triple_helix_DNA

(cấu trúc triple-helix do Pauling đề xuất)

Về phần nhà khoa học Pauling, sau khi khám phá ra cấu trúc của protein, Pauling cũng chú ý đến DNA, nhưng rất tiếc là cấu trúc ‘triple helix‘ của ông đưa ra không chính xác. ‘Triple helix’ nghĩa là 3 chuỗi xoắn xen kẽ vào nhau. Pauling cho gốc phosphate làm lõi (core) của mỗi chuỗi xoắn với các gốc nitrogen hướng ra ngoài, và 3 chuỗi xoắn sẽ cuộn vào nhau để làm thành phân tử DNA. Sai lầm của Pauling là quên rằng các nguyên tử Oxi trong gốc phosphate tích điện âm (), nên khi nằm ở giữa, và các gốc phosphate này chồng lên nhau, chúng sẽ đẩy nhau, không thể tạo ra một phân tử bền vững.

Sau này, Watson đóng vai trò quản lí dự án Human Genome Project, nhằm giải mã toàn bộ bộ gene của con người chứa trong human DNA.

TERM:

  • X-ray crystallography: tinh thể học tia X là kĩ thuật nhằm nghiên cứu cấu trúc 3 chiều của một phân tử bằng cách tạo ra tinh thể từ phân tử đó, sau đó dùng tia X chiếu vào và thu hỉnh ảnh nhiễu xạ của chúng. Sau đó, dùng máy tính để tính toán ra cấu trúc của phân tử dựa vào hình ảnh nhiễu xạ thu được.

SUMMARY:

Watson và Crick là 2 người đã phát hiện ra cấu trúc DNA. Cấu trúc phân tử DNA là chuỗi xoắn kép với chiều xoắn theo chiều tay phải, hay còn gọi là B-DNA. Z-DNA là thuật ngữ dùng để cấu trúc DNA xoắn theo chiều tay trái, nhưng thực tế không tồn tại, ngoại trừ trong môi trướng thí nghiệm.

ĐỌC THÊM:

X-ray crystallography

LINK:

  1. http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/papers/msna-pg01-xl.html (liên kết đến bài báo của Watson-Crick)
  2. http://profiles.nlm.nih.gov/SC/B/B/Y/W/_/scbbyw.pdf (phiên bản PDF của bài báo tại Nature)
  3. http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/2804545.stm (giới thiệu về thành công của Watson-Crick)
  4. http://www.ba-education.demon.co.uk/for/science/dnamain.html (lược sử ra đời của phát hiện cấu trúc ADN)
  5. http://chemistry.library.wisc.edu/subject-guides/x-ray-crystallography.html (chứa các liên kết đầy đủ về database, online learning liên quan đến Tinh thể học tia X)
  6. http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Overview/Overview.html
  7. http://nobelprize.org/educational_games/medicine/dna_double_helix/readmore.html

Di truyền phân tử 4 – eukaryote vs. prokaryote

Trong các phần trước, khi đề cập đến tế bào được dùng để nghiên cứu, chúng đều có nhân. Lớp các tế bào có nhân được gọi là eukaryotic cell (các cá thể có tế bào thuộc lớp này gọi là eukaryotes). Thực tế, còn tồn tại một lớp tế bào không nhân, gọi là prokaryotic cells (các cá thể có tế bào thuộc lớp này gọi là prokaryotes). Thông thường prokatyote là đơn bào (unicellular), nhưng cũng có ít trường hợp là đa bào (multicellular), ví dụ: myxobacteria.

Prokaryotes vs. Eukaryotes

Prokaryotes vs. Eukaryotes

Robert Hooke là người đầu phát hiện ra sự tồn tại của tế bào (1665). Tuy nhiên, đó là tế bào cây (khi quan sát cái nút chai rượu) đã chết; vì thế chúng không có tế bào chất (cytoplasm) nên dẫn đến nhân (nucleus) lúc đó cũng không còn. Vô hình chung nó được xem là tế bào không nhân. 10 năm sau, Anton van Leeuwenhoek (1632-1723), là người đầu tiên, dùng kính hiển vi, đã quan sát được vi khuẩn (bacteria) và động vật nguyên sinh (protozoa).

Bacteria

bacteria cell

Bacterial cell

Vi khuẩn là đơn bào và cũng là prokaryote. Như đã đề cập ở các phần trước, thông tin di truyền được tìm thấy bên trong nhân; nên có nghi vấn đặt ra là liệu vi khuẩn có thông tin di truyền không và nếu có thì chúng di truyền như thế nào?- Câu trả lời là có. Vi khuẩn có 2 phương thức sinh sản (để truyền thông tin di truyền): vô tính (bản thân vi khuẩn tự chia đôi tạo ra 2 vi khuẩn mới – quá trình binary fission), hữu tính (bacteria kết hợp lại và trao đổi thông tin di truyền qua 1 quá trình gọi là tiếp hợp ([bacterial] conjugation)). Sinh sản hữu tính ở vi khuẩn không có sự kết hợp giữa sperm và egg cells như với các eukaryotes, mà chỉ là trao đổi thông tin di truyền từ một vi khuẩn đực, gọi là (+), với vi khuẩn cái, gọi là (-).

Joshua Lederberg (năm 1945) đã tiến hành thí nghiệm trên vi khuẩn E.Coli. E.Coli có khả năng tự tổng hợp ra chất dinh dưỡng cần thiết cho nó, ví dụ: acids methionine (MET), proline (PRO), threonine (THR), vitamin biotin (BIO). Thầy của ông, Edward Tatum, đã tiến hành tạo ra 2 dòng vi khuẩn E.Coli đột biến riêng biệt, mỗi dòng từ duy nhất một tế bào vi khuẩn. Điều này đảm bảo là mọi bacteria của mỗi dòng đều có thông tin di truyền giống nhau.Mục tiêu của đột biến là mỗi dòng mất đi khả năng tổng hợp một số chất dinh dưỡng nào đó.Ví dụ: dòng 1 mất khả năng tổng hợp MET và BIO; dòng 2 mất khả năng tổng hợp PRO và THR. Điều đó có nghĩa là các dòng đột biến này không thể phát triển bình thường; đồng thời, dòng này thì có khả nằng tổng hợp ra các chất mà dòng kia thì không thể, và ngược lại.

Khi nuôi các dòng đột biến này trên dĩa có môi trường phù hợp (thường là agar + proteins, nên gọi là agar plates), các dòng này đều phát triển bình thường. Nhận thấy điều đó, Lederberg đã trộn hai dòng đột biến với nhau, nuôi cấy trên môi trường có chứa cả 4 chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của E.Coli. Lúc này cả 2 dòng đột biến, nhờ có chất dinh dưỡng, đều phát triển bình thường. Sau đó, dùng kĩ thuật phân tách từng vi khuẩn đơn lẻ ra, ông tiếp tục quan sát xem chúng có thể tồn tại tiếp được không. Thật bất ngờ, một số trong chúng vẫn tồn tại và phát triển. Điều đó cho thấy, các E.Coli này đã có đủ bộ genes cần thiết, để có thể tạo ra enzymes tổng hợp các chất dinh dưỡng. Tới đâu câu hỏi đặt ra là? Lí do vì sao từ một mutant bacteria lại trở thành một normal bacteria? – Câu trả lời là vi khuẩn đột biến dòng này đã truyền các gene cần thiết sang vi khuẩn đột biến dòng kia, khi cả 2 được ở chung với nhau.

Bacterial conjugation

Bacterial conjugation

Nghĩa là một vi khuẩn đột biến đã cung cấp bản sao gene của nó cho vi khuẩn khác, giúp vi khuẩn nhận có đẩy đủ bộ gene. Tuy nhiên, tỉ lệ xảy ra khá thấp, 1/10,000,000 vi khuẩn được nuôi cấy. Quá trình trao đổi gene này được Lederberg đặt tên là tiếp hợp ([bacterial] conjugation). Sau này, William Hayes đã kết luận rằng conjugation chỉ xảy ra giữa các vi khuẩn khác  giới tính: (+) và (-). (+) bacteria có nhân tố sinh sản (F+) mà (-) bacteria không thể có (F-). Cụ thể, một cầu nối (gọi là pilus) từ (+) bacteria sang (-) bacteria giúp cho F factor di chuyển từ vi khuẩn (+) sang vi khuẩn (-). F+ bacteria đóng vài trò là người cho (donor), và F- bacteria sau khi nhận F-factor cũng trở thành donor, hay nói cách khác là trở thành F+ bacteria.

F-factor (A) independent, (B) integrated

F-factor (A) independent, (B) integrated

F-factor là một phân tử extra-chromosomal DNA, có thể tồn tại ở dạng tự do, hoặc tích hợp vào trong DNA (chromosomal DNA). Dù ở trạng thái nào, nó vẫn có vai trò như nhau. F-factor là một loại thuộc plasmid, nên còn có tên là F-plasmid. Trên F-plasmid, có hai vị trí (locus, Latin = place) gọi là tratrab chứa khoảng 40 genes; trong đó tra locus có chứa gene pilin và một số gene điều khiển giúp tạo ra pilus cho vi khuẩn; và tạo ra một số genes khác cần thiết cho quá trình bacterial conjugation.

Khi F-factor ở dạng tích hợp, mỗi khi nó được truyền từ bacteria này sang bacteria khác, chromosomal DNA cũng sẽ được truyền theo. Tuy nhiên, tuỳ vào thời gian của cầu nối pilus mà một phần, hay toàn bộ chromosomal DNA có thể được truyền. Thời gian để truyền hết bộ chromosomal DNA của vi khuẩn là 100 phút. Và phần chromosomal DNA truyền đi sẽ kết hợp với chromosomal DNA của bacteria mới, thông qua quá trình gọi là recombination. Quá trình này xảy ra khá thường xuyên (high frequency) với vi khuẩn có integrated F-factor, cho nên vi khuẩn có integrated F-factor còn được gọi là Hfr (High frequency).

Bacteriophage

Nhà khoa học Alfred Hershey, lại nghiên cứu di truyền trên virus mà chỉ nhằm tấn công và lây nhiễm vi khuẩn. Các virus này đưọc gọi là bacteriophage, hay phage. Mục đích của việc lây nhiễm là phage dùng bộ máy của vi khuẩn để giúp nó sinh sản. Phage có một lớp vỏ bọc bằng protein và chứa bên trong là thông tin di truyền (DNA). Phage muốn sinh sản phải dựa vào cơ chế sinh sản của vi khuẩn. Phage dùng các chân của mình để bám vào vi khuẩn; sau đó, DNA của phage sẽ được đưa vào vật chủ vi khuẩn và sử dụng các enzyme của vi khuẩn để nhân đôi DNA của phage. Khi số lượng phage bên trong vật chủ đủ lớn, nó sẽ phá vỡ vật chủ vi khuẩn để thoát ra ngoài.

Để kiểm tra phage đưa DNA của nó vào bacteria, hay cụ thể DNA là nơi lưu trữ thông tin di truyền, Hershley và Martha Chase đã tiến hành thí nghiệm. Từ thực nghiệm, DNA có hàm lượng nguyên tố phospho (P) cao; trong khi protein có hàm lượng nguyên tố lưu huỳnh (sulfur – S) cao. Vì thế, họ đã dùng các nguyên tố đánh dấu phóng xạ (P32 và S35) – radioactive label (hay radioactive tracer) – để đánh nhãn protein và DNA của phage. Các đánh nhãn đồng vị phóng xạ giúp phát hiện vị trị của các phân tử mà nó liên kết vào. Từ đó, có thể biết là thành phần nào lây nhiễm vào trong vi khuẩn. Cụ thể, họ cho 2 mẫu vi khuẩn để thí nghiệm song song, mỗi mẫu cho một loại đồng vị vào. Sau khi cho phage vào mỗi mẫu và đợi cho phage bám vào bacteria đủ lâu, họ dùng máy ly tâm lắc nhằm phân tách vi khuẩn và phage. Vì vi khuẩn nặng hơn, nó sẽ lắng xuống đáy, còn phage ở trên.

Phage và Bacteria sau khi phân li, tại mỗi mẫu

Phage và Bacteria sau khi phân li, tại mỗi mẫu

Xem xét với ống nghiệm có S35, Hershley thấy S35 nằm chung với phage, bên trong vi khuẩn không có S35. Vì thế, protein, không được dùng bên trong vi khuẩn để tạo ra các bản sao con của phage. Khi xem xét với mẫu còn lại, P32 nằm cả với bacteria và phage mới tạo ra. Vì thế, có thể kết luận phage DNA đã xâm nhập vào vi khuẩn; phage DNA chứa mọi thông tin giúp vi khuẩn bị lây nhiễm có thể tạo ra phage mới. Một lần nữa, (phage) DNA lại được chứng thực là chứa thông tin di truyền, chứ không phải là protein.

E.Coli bị vây quanh bởi T4 bacteriophage

TERM:

  • cell (Latin, cella = “a small room”): tế bào, thuật ngữ được đặt bởi Robert Hooke
  • eukaryote (eu=true, karyon=nucleus): cell with true nucleus
  • prokaryote (pro=pre, ….): cell without a nucleus
  • nucleus: nhân tế bào, được phát hiện lần đầu tiên bởi nhà thực vật học Robert Brown (1773-1858), và cũng là người đặt tên thuật ngữ.
  • plasmid (hay còn gọi là vectors – thuật ngữ trong kĩ thuật di truyền): là một phân tử extra-chromosomal DNA, tồn tại tách biệt với chromosomal DNA. Thông thường nó là hình tròn, và chuỗi kép (double strand). Plasmid, trong tự nhiên, thường chỉ thấy trong vi khuẩn. Kích thước nó dao động khá lớn (1-1000kpb). Mỗi cell (bacteria) có thể có một hay nhiều loại plasmid, số lượng mỗi loại cũng dao động nhiều. Thuật ngữ do Joshua Lederberg đặt (1952).
  • F factor (fertility factor – nhân tổ sinh sản, hay F-plasmid, sex factor): là nhân tố quyết định khả năng tạo thành sex pilus, đóng vai trò thiết yếu cho conjugation. Nó thực ra là một đoạn DNA có thể tồn tại độc lập trong cytoplasm của vi khuẩn hoặc kết hợp với DNA của vi khuẩn thông qua cơ chế recombination (sẽ đề cập ở 1 bài riêng).
  • DNA của vi khuẩn sau khi có thêm F+ factor gọi là recombined DNA.
  • [sex] pilus (Latin, “hair”, pl. pili): kích thước 6-7nm, là phần đối có dạng như sợi tóc gắn với bề mặt một số vi khuẩn. Nó xác định tính đực (+) của vi khuẩn. Chỉ những vi khuẩn có F-factor (hay F-plasmid, fertility factor) mới có pilus
  • [bacterial] conjugation: là quá trình sinh sản hữu tính của vi khuẩn, cụ thể là quá trình trao đổi thông tin di truyền qua cầu nối pilus.

SUMMARY:

Vi khuẩn cũng có DNA, nguyên liệu di truyền. Phage sinh sản bằng cách lây nhiễm vào host bacteria. Bacteria có thể sinh sản vô tính hay hữu tính, tuỳ vào cá thể có chứa F-plasmid hay không.

Tham khảo:

  1. http://www.biology.arizona.edu/Cell_BIO/tutorials/pev/main.html
  2. http://www.nature.com/ncb/journal/v1/n1/full/ncb0599_E13.html
  3. http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/unity/cell.text.htm
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15522508 (Multicellular life cycle of magnetotactic prokaryotes.)
  5. http://www.hhmi.org/biointeractive/animations/conjugation/conj_text3.htm (xem Demo về conjugation)
  6. http://www.lanesville.k12.in.us/LCSYellowpages/Tickit/Carl/bacteria.html

Di truyền phân tử 3 – DNA make up gene

Trong phần 1, ta biết DNA và protein đều quan trọng trong nhân tế bào. Phần 2 cho ta biết gene đóng vai trò chính tạo ra protein. Vậy gene nằm ở đâu? Trong phần 1, Leuvene và nhiều nhà khoa học khác vẫn cho rằng protein chứa gene. Như vậy bài toán “the egg and the chicken” xảy ra, nghĩa là gene tạo ra protein và protein chứa gene. Vậy quan điểm “protein chứa gene” đúng hay sai? Phần này, ta muốn khẳng định rằng chính DNA mới chứa gene – một gene là một đoạn của DNA. Điều này chỉ được làm sáng tỏ vào thập niên 1940.

Oswald Avery (tại Rockfeller Institute, thập niên 1940) cùng đồng nghiệp đã tiến hành thí nghiệm trên vi khuẩn Pneumococcus, loại gây ra bệnh viêm phổi (pneumonia). Pneumococcus phát triển trong cơ thể vật chủ (ví dụ: chuột), nhưng đồng thời cũng có thể phát triển trong môi trường cấy lỏng hoặc đặc.

Từ năm 1928, Fred Griffith công bố 2 dòng khác nhau của Pneumococcus: S và R.

  • dòng S có khả năng gây ra bệnh (có bề mặt trơn nhẵn do có vỏ bọc)
  • dòng R thì vô hại (có bề mặt thô ráp)

Do cả 2 dòng S và R đều có thể được tìm thấy trên một mẫu bệnh. Nên Griffith suy đoán là từ dòng này có thể chuyển sang dòng kia. Để trả lời nghi vấn, ông đã thử nghiệm và phát hiện ra rằng dòng vi khuẩn R vô hại này vẫn có thể gây bệnh khi nó gặp phải virus của dòng S đã chết (virulent strain of bacteria) – dĩ nhiền dòng S đã chết thì bản thân không còn khả năng gây bệnh nữa. Như vậy, virus của dòng S đã chết có thể đã cung cấp thành phần hóa học nào đó giúp cho quá trình chuyển đổi (transform) từ dòng vô hại sang có hại – gọi là dòng S được nuôi cấy (S strain cultured). Đồng thời, dòng S được nuôi cấy này khi đưa sang con chuột khác khỏe mạnh cũng gây bệnh, nghĩa là sự thay đổi này có tính ổn định và kế thừa (stable & inherited).

Vậy có thể nào virus của dòng S chết đã cung cấp một gene nào đó cần thiết cho quá trình hóa học giúp chuyển virus từ dòng R vô hại sang có hại. Câu trả lời dành cho Oswald Avery.

Avery cùng với Colin Macleod, Maclyn McCarty bắt đầu tìm hiểu câu trả lời cho nguyên lí này. Họ không làm trực tiếp trên chuột mà dùng môi trường ống nghiệm (test tube assay) và dùng chất tẩy (detergent) để phá vỡ (lyse) các tế bào của dòng S đã bị chết. Các mãnh vở tế bào (cellular debris) sẽ được lắng xuống và dễ dàng tách các mảnh vỡ (lysate) nằm ở trên ra (lysate chính là thành phần bên trong của một tế bào đã được dung giải: gồm có lớp vỏ bọc tế bào (coat), protein, phân tử DNA và RNA).

Khi đưa lysate vào với dòng R thì nó sẽ tạo ra dòng gây bệnh. Vậy có thể chắc chắn là một thành phần bên trong lysate đã giúp chuyển hóa từ dòng R vô hại sang có hại. Để tìm ra thành phần nào bên trong lysate quyết định đến quá trình chuyển đổi R thành S, họ làm từng bước:

  • Đưa enzyme SIII vào để “ăn” hết phân tử đường làm vỏ bọc –> vẫn tạo ra dòng S từ dòng R. Như vậy, phân tử đường không đóng vai trò giúp chuyển hóa dòng R thành dòng S.
  • Họ cho tiếp enzyme (trypsin + chymotrypsin) tiêu hóa protein vào mẫu đã bị tách đường ở trên –> vẫn tạo ra dòng S từ dòng R. Như vậy, protein không đóng vai trò giúp chuyển hóa từ dòng R sang S.
  • Họ cho tiếp rượu (alcohol) vào –> họ lần đầu tiên tách được nucleic acids kết tủa (precipitate) ra khỏi Pneumococcus. Và họ tin rằng, có thể chính một trong các nucleic acids (DNA hay RNA) quyết định đến sự chuyển đổi. Họ hòa tan nucleic acids kết tủa vào trong nước. Tiếp, hủy RNA bằng RNase enzyme và kiểm tra quá trình chuyển đổi.

+ No coat, no protein, no RNA: –> vẫn tạo ra dòng S từ dòng R.

Còn lại cuối cùng là DNA, họ hủy DNA bằng cách đưa vào enzyme tiêu hóa DNA (DNase enzyme)

+ No coat, no protein, no RNA, no DNA: –> kết quả thu được là dòng R. Như vậy nó mất khả năng tạo ra dòng S từ dòng R.

Tiếp, họ thay S-strain DNA bằng R-strain DNA thì DNA của R không thể tạo ra dòng S từ R được do DNA của R thiếu gene cần thiết để tạo ra được lớp vỏ bọc bằng đường (sugar coat). Việc tạo ra lớp vỏ bọc này sẽ giúp dòng R (R strain) chuyển thành dòng S.

Khi phân tách ra dung dịch có chứa DNA, Avery và cộng sự nhận thấy nó có tính chất sệt, dày, và quánh (viscous, thick & stringy). Sau khi hủy DNA, thì dung dịch không còn tính chất đó nữa. Kết quả thu được cũng tương tự khi họ lắc mạnh dung dịch DNA. Việc lắc mạnh này làm gãy cấu trúc của DNA thành các mảnh nhỏ. Và khi đưa kết quả này vào với dòng R, thì cũng không tạo ra dòng S, nghĩa là việc làm đứt gãy DNA cũng làm mất tác dụng của gene hay các đoạn DNA không đủ dài để chứa gene. Khi chia đôi phân tử DNA, thì một bên có khả năng tạo ra dòng S khi kết hợp với dòng R, còn nửa còn lại thì không. Như vậy, có thể kết luận rằng gene là một đoạn DNA (đủ dài). Năm 1944, kết quả được công bố “DNA của S đóng vai trò quan trọng và là nơi lưu giữ gene.”

Qui trình nghiên cứu của Griffith.

Griffith phát hiện là chuột bị nhiễm dòng S thì phát triển bệnh viêm phổi và chết vài ngày sau đó. Nguyên nhân là do dòng S có lớp vỏ bọc hình viên nhộng (capsule-like coat) tạo bởi các phân tử đường giúp nó ngăn hệ miễn dịch của vật chủ (host’s immune system) tiêu diệt vi khuẩn. Vì thế, dòng S là lây nhiễm (infectious).

Griffith nhận thấy rằng cả hai dòng khác nhau đều có thể được nuôi cấy (culture) từ cùng 1 vật chủ. Vậy, có thể nào từ dòng này chuyển sang dòng kia? Ông đã làm thí nghiệm:

- nung nóng dòng S để làm chết vi khuẩn, sau đó

+ nếu đưa vào cơ thể chuột dòng S đã bị chết, vi khuẩn bị nhiệt độ làm chết đã không còn khả năng gây bệnh nữa.

+ nếu đưa vào cơ thể chuột dòng S đã bị chết đồng thời với dòng R còn sống thì chuột lại bị nhiễm bệnh viêm phổi và chết. Và từ con chuột chết này, Griffith đã có thể lấy ra dòng S còn sống. Như vậy, từ dòng R có thể chuyển sang dòng S và câu hỏi đặt ra là: bằng cách nào?

CONCLUSION:

DNA là nơi lưu giữ thông tin di truyền, cụ thể là gene. Gene là một phần trong chuỗi phân tử DNA. Đồng thời, ta cũng biết thêm rằng vi khuẩn cũng có DNA.

LINK:

  1. http://profiles.nlm.nih.gov/ (Profiles các nhà khoa học trong biomedical research và public health)

Di truyền phân tử 2 – one gene create one protein

Trong phần trước, ta đã bàn về một số quan điểm và lý thuyết sơ khởi về vai trò của DNA cùng protein đối với tế bào. Vì là sơ khởi, chúng có thể không chính xác.  Ví dụ quan điểm protein lưu giữ thông tin di truyền là sai (sẽ được nói trong phần 3). Protein đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết các quá trình hóa học bên trong cơ thể, đảm bảo cho các tế bào hoạt động đúng chức năng. Trong phần này, ta sẽ tìm hiểu sự ra đời của việc khám phá ra protein là sản phẩn của gene.

Năm 1902, Archibald Garrod đã mô tả bệnh ancapton niệu (alkaptunoria) (đã đề cập trong phần 9 của di truyền cơ bản) là do “lỗi bẩm sinh trong quá trình trao đổi chất (inborn errors in metabolism) – tức là có những thiếu sót hoặc giai đoạn bị lỗi trong quá trình hóa học phát triển của cơ thể khiến cho cơ thể không tự sản sinh ra những chất dinh dưỡng (nutrients) cần thiết, dẫn đến việc cơ thể phát triển chậm hoặc không thể phát triển được.” Cụ thể là với người bị bệnh ancapton niệu, có một đột biến gene (nào đó liên quan) đã gây ra sự thiếu sót làm cho quá trình sinh hóa loại bỏ chất thải lỏng (nước tiểu…) ra khỏi cơ thể không thực hiện được. Kiểu hình (phenotype) biểu hiện của bệnh này là nước tiểu màu đen (dark urine).

Năm 1941, George BeadleEdward Tatum thí nghiệm với Neurospora crassa - vi khuẩn mốc bánh mì màu đỏ (red bread mold) với mục đích chứng tỏ lí thuyết của Archibald Garrod – đột biến xảy ra là do sai sót xảy ra trong quá trình trao đổi sinh hóa (biochemical pathways). Cụ thể là khi dùng tia xạ với khuẩn mốc bánh mì màu đỏ – mốc bị đột biến – chúng mất khả năng tổng hợp chất dinh dưỡng, dẫn đến chậm hoặc không thể phát triển của mốc. Sau đó, bằng cách cho vào mốc đã bị đột biến đó chất bổ sung, thì quá trình phát triển lại được hồi phục. Hai nhà khoa học suy luận rằng đột biến gene đã vô hiệu hóa (inactive) một enzyme (a type of protein) nào đó cần thiết cho quá trình tổng hợp chất dinh dưỡng. Nghĩa là, gene đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein.

DETAILS:

Neurospora là vi khuẩn chỉ với một bộ chromosome (haploid) trong hầu hết vòng đời, nghĩa là chỉ có 1 bản sao của mỗi gene (vì thế không phải quan tâm về allele trội hay lặn ở đây).

Neurospora có thể được nuôi cấy trên môi trường tối thiểu (minimal media): với agar có chứa ít đường đơn, muối vô cơ (inorganic salts), và vitamin biotins… Và từ các chất này, vi khuẩn sẽ có cách để tự tổng hợp ra chất dinh dưỡng cần thiết để phát triển.

Quá trình tổng hợp ra chất dinh dưỡng luôn cần thiết có các enzyme (protein hoạt hóa). Vấn đề đặt ra ở đây là đột biến gene có ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất dinh dưỡng không – hay nói cụ thể là đột biến gene có ảnh hưởng gì với enzyme.

Năm 1927, Herman Muller cho thấy tia X (X-rays) có thể gây ra đột biến ở gene. Vì thế, 2 nhà khoa học đã dùng tia X chiếu vào Neurospora, hi vọng là có thể thu được một số đột biến hiếm mà với môi trường nuôi cấy thông thường, ta không thể thu thập được. Sau khi chiếu tia X vào, họ đem các mẫu thu được nuôi cấy trên môi trường tối thiểu, thì thấy chúng hầu hết vẫn phát triển bình thường. Chứng tỏ chưa có loại đột biến mà làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Tuy nhiên, may mắn là vẫn có một mẫu không phát triển.

Hai chất đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của mốc là amino acids và vitamins. Nên họ lấy mẫu trên, chia làm hai phần rồi nuôi cấy (culture) trên môi trường tối thiểu, lần này có bổ sung thêm amino acids vào phần 1 và vitamins vào phần 2. Kết quả cho thấy, mốc phát triển tốt với môi trường có bổ sung vitamins, nhưng lại không phát triển trong môi trường có bổ sung amino acids. Như vậy, có thể khẳng định mốc bị đột biến này không có khả năng tạo ra một trong số các vitamins.

Bây giờ, để tìm hiểu là thiếu vitamin nào, họ đã thử đưa từng loại vitamin một vào môi trường tối thiểu.

Kết quả cho thấy là B6 chính là vitamin bị thiếu, hay vi khuẩn bị đột biến không có khả năng sản xuất ra vitamin B6 vì một enzyme nào đó tham gia vào quá trình tổng hợp ra B6 (B6 synthesis pathway) đã bị ảnh hưởng. Có nghĩa là việc đột biến gene dẫn đến sự không hình thành enzyme giúp cho quá trình tổng hợp B6 hay gene đóng vai trò tạo ra enzyme (protein).

Dùng qui trình ở trên, họ cũng phát hiện được nhiều loại đột biến khác nữa. Ví dụ: amino acid Arginine được tổng hợp thông qua một loạt các bước và mỗi bước phụ thuộc vào một enzyme khác nhau.

Vì thế, nếu một trong các gene mã hõa cho các enzyme (ornithine, citrulline, arginine) này bị sai lệch thì sẽ ảnh hưởng đến metabolic pathways tạo ra Arginine. Nghĩa là bên cạnh dòng đột biến arginine, còn tồn tại các dòng đột biến mà cần bổ sung citrulline, hoặc ornithine. Những phát hiện này do Adrian Srb và Norman Horowitz, 1944. Đồng thời, mỗi gene bị đột biến chỉ ảnh hưởng đến việc hình thành 1 enzyme nhất định, nghĩa là 1 gene chỉ đóng vai trò với 1 protein duy nhất – “one gene, one enzyme”.

TERM:

  • Enzyme: là một loại protein, đóng vai trò xúc tác (catalysis), giúp cho các quá trình sinh hoá trong tế bào diễn ra theo yêu cầu (tăng tốc hoặc giúp các phản ứng hóa học bên trong tế bào được diễn ra).
  • Gene expression: là để chỉ quá trình sản xuất ra protein từ gene.

CONCLUSION:

Một đột biến gene (gene mutation) có thể dẫn đến vô hiệu hóa (inactive) biểu hiện gene (gene expression). Kết quả là enzyme (protein) sản phẩm của gene này sẽ không được tạo ra.  Đồng thời, một gene chỉ chịu trách nhiệm chứa thông tin tạo ra tối đa một enzyme hay một protein duy nhất. Trong thực tế, không phải mọi gene đều tạo ra protein. Những gene mã hóa cho protein thì gọi là protein-coding genes. Các quá trình sinh hoá cần đến sự trợ giúp của enzyme này, vì thế không thể xảy ra. Hậu quả có thể rất nghiêm trọng đối với sự phát triển của cơ thể.

LINK:

  1. http://www.ux.uis.no/~ruoff/Neurospora_Rhythm.html (các giai đoạn của đời sống vô tính của Neurospora)
  2. http://www.fgsc.net/Neurospora/neuros.htm (genome của Neurospora)

Di truyền phân tử 1 – DNA & protein are key molecules in cell nucleus

Trong phần di truyền cơ bản, ta đã nói về các thuật ngữ genes, chromosome … ở mức độ ý niệm. Trong phần di truyền phân tử, ta sẽ tìm hiểu cấu trúc hóa học thực và bản chất của các khái niệm đó.

Friedrich Miescher là nhà vật lí Thụy Sĩ đã tìm hiểu về thành phần hóa học của tế bào. Năm 1869, ông đã bắt đầu tìm hiểu tế bào máu trắng (white blood cells). Tế bào máu trắng là thành phần chính tạo thành mủ (pus) ở các vết thương. Ông đã thu thập các mủ dính tại các băng dán y tế bằng cách ngâm vào dung dịch muối (salt solution). Sau đó, cho dung dịch kiềm yếu (weak alkaline solution) vào, các tế bào sẽ được dung giải (lyse) và các nhân tế bào (cell nuclei) sẽ kết tủa (precipitate) tách ra khỏi dung dịch.

Từ nhân tế bào (nuclei), ông đã phân tách ra được một thành phần hóa học duy nhất, ông gọi là nuclein (nghĩa là nằm trong nhân). Và nuclein tồn tại ở trong mọi tế bào mà ông đã thử nghiệm.

NOTE: Sau này, người ta mới biết rằng nuclein chính thực ra là chromosomes.

Về mặt hóa học, nuclein có chứa rất nhiều phospho, và Miescher nghĩ rằng nuclein đóng vai trò là nơi lưu trữ các phân tử phospho (phosphorous atom) cho tế bào. Lúc đó, Miescher vẫn chưa nghĩ hay tìm ra được chức năng sinh học nào khác của nuclein. Việc này phải nhờ đến Phoebus Levene. Đầu thập niên 1900, Levene cho biết nuclein mà Miescher đề cập chính là hỗn hợp giữa proteins nucleic acids (cụ thể là ADN).

NOTE: Có 2 loại nucleic acids: DNA và RNA.

  • DNA tìm thấy chủ yếu trong nhân tế bào
  • RNA tìm thấy chủ yếu trong tế bào chất (cytoplasm)

Một số thông tin về proteins:

  • được tạo thành ban đầu bởi từ 20 đơn vị nhỏ gọi là amino acids (monomers). Chú ý là các amino acids này có thể bị biến đổi (ví dụ: acetylation – là việc thêm acetyl group vào amino group ở một đầu cuối N-terminal residue) trong chu trình sống của protein.
  • các phân tử amino acids này sẽ liên kết với nhau để tạo thành chuỗi proteins (polymer) với hình dáng và kích thước khác nhau – gọi là polypeptide.

Ví dụ: chỉ với chuỗi gồm 4 amino acids thuộc từ 20 loại amino acids đó, ta có thể tạo ra 20^4 = 160000 sự kết hợp. Do đó, có thể nói rằng proteins có đủ mọi kích cỡ và hình dáng khác nhau.

Một số thông tin về DNA (do Leuvene nghiên cứu):

Nếu với proteins được tạo thành tử 20 đơn vị khác nhau thì phân tử DNA chỉ có 4 đơn vị tạo thành, gọi là nucleotides.

Mỗi phân tử nucleotide được tạo thành từ 3 thành phần:bazơ có nhóm phosphate (mono-phosphate, pyrophosphate hoặc tri-phosphate), đường deoxyribose (đối với DNA) hoặc đường ribose (đối với RNA), và bazơ có chứa nitrogen (nitrogenous base).

Vì trong nitrogenous base cũng có nguyên tố Carbon và được đánh số 1,2… nên nguyên tố Carbon trong phân tử đường được đánh số từ 1-5 kèm theo kí hiệu primer (’). Theo hình vẽ, nitrogenous base luôn gắn vào C-1′, (với RNA, C-2′ sẽ gắn với -OH, thay vì  proton -H như trong DNA), nhóm hydroxil -OH (hydroxil group) thì gắn vào C-3′ (nơi sẽ diễn ra liên kết phosphodiester với nucleotide khác để tạo ra chuỗi polymer), và gốc phosphate thì gắn vào C-5′.

Như vậy, sự khác nhau giữa 4 nucleotides là ở nitrogenous base, được phân làm 2 loại: purine (Guanine, Adenine) pyrimidine (Cystosine, Thymine).

Để tạo thành DNA, Leuvene phát hiện rằng các phân tử nucleotides liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester (phosphodiester bond): 1 nhóm phosphate liên kết với hai phân tử đường: sugar thứ nhất là cùng nằm trên một phân tử nucleotide chứa bản thân gốc phosphate đó (gốc phosphate liên kết với C5′ của sugar) và sugar thứ hai thuộc một nucleotide khác (gốc phosphate liên kết với C3′ của sugar). Và ta lấy C5′ của sugar thuộc nucleotide có chứa gốc phosphate làm đầu (head) – tức là nơi sẽ không tiếp tục nhận thêm residue, còn C3′ của sugar còn lại làm đuôi (tail) – nơi có thể nối thêm residue. Như vậy, hướng liên kết trên chuỗi DNA là từ C5′ tới C3′ hay 5′ (5 prime) đến 3′ (3 prime).

DNA vs. Protein:

Ở các phần trước, ta đã biết nguyên liệu di truyền chứa trong nhân và cụ thể là nuclein (chromosomes). Câu hỏi đặt ra là: nguyên liệu di truyền là proteins hay DNA? Tại thời điểm này, mọi quan điểm đều cho rằng protein mang nguyên liệu di truyền. Lí do là vì khi so sánh protein và DNA, họ thấy rằng protein phức tạp hơn và các nhà khoa học cho rằng muốn lưu giữ nguyên liệu di truyền thì phải là rất phức tạp (Quan điểm này thực ra không đúng – sẽ được đề cập rõ ở các phần sau vì thực ra DNA mới mang nguyên liệu di truyền và protein là sản phẩm của nguyên liệu di truyền, đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện mọi chức năng của tế bào).

Levene nghiên cứu thành phần hóa học của DNA và thấy DNA được tạo thành từ 4 đơn vị, ít hơn nhiều so với số đơn vị của proteins, Leuvene đã đưa ra một lí thuyết gọi là “tetranucleotide theory” (sau này đã được chứng thực là không đúng). Ông cho rằng, số lượng của từng loại nucleotides trong một phân tử DNA là như nhau. Theo đó, ông quan điểm là mỗi phân tử DNA được tạo thành bởi các khối, mỗi khối chứa 4 nucleotides, gọi là “tetranucleotide block“. Trong mỗi khối, các nucleotide được sắp xếp với trật tự cố định như nhau, và mỗi nucleodie chỉ xuất hiện 1 lần. Như vậy trong phân tử ADN, theo lý thuyết này, ta luôn có A=T=G=C. Quan điểm này đã được chấp nhận rộng rãi trong thập kỉ 1920 và 1930.

Với quan điểm như thế, đến năm 1938, Leuvene cho rằng DNA không đủ “thông minh” để chứa/mã hóa các thông tin di truyền. Vì thế, ông cho rằng chính proteins mới là nguyên liệu di truyền cấp phân tử.

Read the rest of this entry »

Di truyền cơ bản 10 – inheritance on human and multi-gene trait

Trong các phần trước, ta đã đề cập đến di truyền trên cây đậu Hà Lan và ruồi giấm. Vậy, các định luật di truyền được áp dụng trên người như thế nào? Những tìm hiểu về các căn bệnh gặp phải ở trong phả hệ/nòi giống của một số gia tộc (pedigrees of families) đã cho thấy những ví dụ đầu tiên về sự di truyền (về bệnh tật) ở người.

Các di truyền lặn (recessive inheritance) được mô tả lần đầu đối với các rối loạn ancapton niệu (disorder alkaptonuria, 1902) hay chứng bạch tạng (albinism, 1903). Và các bệnh về di truyền trội như bệnh tay ngắn (brachydactyly, 1905), bệnh đục nhân mắt bẩm sinh (congential cataracts, 1906), chứng múa giật (Hungtinton’s chorea, 1913), sự loạn dưỡng ở cơ (Duchenne muscular dystrophy, 1913), bệnh mù màu xanh-đỏ (red-green color blindness, 1914), bệnh ưa chảy máu (hemophilia, 1916) là những căn bệnh di truyền liên quan đến giới tính (X-linked or sex-linked disorders).

Đồng thời người ta còn phát hiện ra rằng, một tính trạng không phải chỉ được qui định bởi duy nhất 1 gene (với tối đa 2 kiểu hình), vì có những tính trạng được qui định bởi nhiều genes (với nhiều hơn 2 kiểu hình, ví dụ: màu mắt nâu, xanh, đen, xám, …)

Từ xưa, việc hôn phối giữa những người cùng dòng tộc được xem là cách để bảo tồn nòi giống cao quí của mình. Vì thế, những căn bệnh mang tính di truyền liên quan đến giới tính cũng được truyền từ đời này sang đời khác. Ta hãy xem một ví dụ về dòng họ của Nữ hoàng Anh Victoria. Bà đã mang gene của căn bệnh ưa chảy máu (hemophilia), căn bệnh được xem là chỉ biểu hiện ở đàn ông.

  • Vòng tròn: đại diện cho nữ
  • Hình vuông: đại diện cho nam
  • Gạch nối ngang: quan hệ vợ chồng
  • Gạch nối đứng: quan hệ bố mẹ/con cái
  • Hình vuông tô đen: người bị ảnh hưởng bởi bệnh (affected male)
  • Hình tròn có chấm đen: có mang gene của bệnh, nhưng bản thân không bị bệnh (carrier female)

Cặp Albert-Victoria có 1 người con trai tên Leopold mang bệnh, 2 người con gái được xem là có mang gene gây bệnh, vì con của họ có xuất hiện bệnh. Cháu gái của họ, Alexandra do có mang mầm bệnh, nên khi cưới sa hoàng (tsar) Nicholas đệ Nhị, đã có con trai tên Alexei bị bệnh.

Bệnh ưa chảy máu do 1 gene trên chromosome X qui định (kí hiệu: allele lặn gây bệnh là h, allele trội không gây bệnh là H)

Tiếp đến là ví dụ về màu mắt: Charles Davenport, thiết lập Eugenics Record Office (ERO) năm 1910 nhằm tìm hiểu ứng dụng của di truyền giúp cho cuộc sống con người tốt hơn, đã có những nghiên cứu đầu tiên về di truyền của màu mắt. Họ tin rằng mọi tính trạng (trait) của con người đều di truyền theo qui luật di truyền về gene của Mendel. Tính trạng trội của màu mắt thường được xem là màu đen.
Một phụ nữ mắt nâu mà dòng họ từ nhiều đời có màu mắt nâu, nên có thể xem cô ấy có gene biểu hiện màu mắt là đồng nhất (homozygous). Cô cưới một người đàn ông có màu mắt xanh, cũng có gene biểu hiện màu mắt là đồng nhất.

Con cái của họ đều có màu mắt nâu, vậy màu nâu là màu mắt trội. Tỉ lệ màu mắt brown:blue ở F2 là 3:1, tuân theo tỉ lệ trội : lặn của Mendel. Điều này có vẻ hợp lí. Song, trên thực tế, các nhà khoa học ngày nay chứng tỏ được rằng màu mắt được qui định bởi 2 hoặc 3 genes . Do đó, các cố gắng để giải thích màu mắt là di truyền bởi hệ thống 1 gene đơn lẻ là không thuyết phục. Cụ thể qua sự chênh lệch về màu sắc với các mức độ khác nhau; đó được hiểu là do kết quả của sự biến đổi biểu hiện của các gene (gene expression) qui định tính trạng màu mắt ở từng cá nhân cụ thể.

Một ví dụ khác về căn bệnh di truyền ít nguy hiểm là ancapton niệu do Archibald Garrod phát hiện:

  • John bị bệnh và bà ngoại cậu ta bị bệnh
  • Bà ngoại của cậu có một người em trai cũng bị bệnh, và người em trai này là bố của mẹ John. Vậy mẹ của John và bố của John là anh em cậu gì (cùng huyết thống, cùng dòng máu – consanguineous), trong quan hệ gia phả, nó được biểu diễn bởi gạch ngang đôi

Cả bố và mẹ của John đều không mắc bệnh này, có nghĩa là họ đều mang gene gây bệnh capton niệu không đồng nhất (với 1 allele trội, 1 allele lặn, và cặp allele lặn đã được truyền cho John). Archibald Garrod cho rằng các bệnh di truyền lặn thường biểu hiện ra bên ngoài trong các gia đình có quan hệ huyết thống (consaguineous relationship)

CONCLUSION:
Qua các thông tin đã thu thập được ở các phần, ta có thể nói rằng di truyền của Mendel không lí giải đầy đủ sức khỏe và tính cách của con người. Tính cách của con người rất phức tạp, hay các bệnh về tâm thần (mental illness), chúng được qui định bởi rất nhiều gene, và còn do các yếu tố khác như môi trường chính trị xã hội bên ngoài cấu thành, chứ không đơn thuần là yếu tố di truyền.

LINK:

  1. http://www.genome.gov/27026388 (Chương trình chữa trị các chứng bệnh về di truyền chưa được biết đến của NIH)
  2. http://www.hhmi.org/genetictrail/

Di truyền cơ bản 9 – tiến hóa

Từ 1895, Darwin đã đưa ra quan điểm về sự tiến hóa – đó là một quá trình chọn lọc tự nhiên (natural selection) với mục tiêu giúp tăng cường khả năng chịu đựng, thích nghi của mỗi chủng loài/cá thể. Qua phần 8,  ta biết rằng crossover đóng một vai trò quan trọng trong sự đa dạng hóa các kiểu hình của tính trạng của loài. Vậy câu hỏi đặt ra là: các biến đổi trong di truyền xảy ra như thế nào và chúng có ảnh hưởng thế nào (tốt/xấu) đối với loài? Ta sẽ tìm hiểu ở đây: phần đầu là đối với cây trồng, phần sau là đối với người.

George Shull là một nhà khoa học gắn bó với cây trồng và ông đặc biệt quan tâm tới thuyết tiến hoá của Darwin. Với yêu cầu, tạo ra các đột biến có chọn lọc nhằm tạo ra các giống cây trồng, vật nuôi có traits tốt, các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn tới sự lai tạo giữa các tính genes. George Shull, năm 1905, bắt đầu tiến hành với cây ngô lai (corn hybrids) để đánh giá sự di truyền của các đột biến phát triển và tác động tới cây như thế nào.

Trong tự nhiên, các cây ngô này được thụ phấn chéo (cross-pollinated) với nhau nhờ có gió mang phấn từ cây này thụ phấn sang cây khác. Do đó, trong một ruộng ngô, các cây con sẽ có hình dáng, sức chịu đựng (vigour), năng suất (yield)… khác nhau.

Shull bắt đầu tiến hành bằng cách tự thụ phấn cho cây (self-pollinating, self-fertilized) – cây không nhận phấn từ cây nào khác ngoài nó. Sau 7 thế hệ được làm như thế, ông đã tạo ra các dòng thuần chủng (pure-bred lines of corn) giống như Mendel đã từng làm với cây đậu Hà lan. Đặc biệt thú vị là các dòng thuần chủng này càng ít khả năng chịu đựng, phát triển chậm và cho ra năng suất rất kém so với ngô được thụ phấn trong tự nhiên.

Nếu ông đem lai 2 cây ngô thuộc 2 dòng thuần chủng khác nhau với nhau, thì ông thấy năng suất tăng lên với cây thuần chủng ban đầu. Cây lai cho năng suất cao gấp đôi cây thuần chủng, và cao hơn 10%-20% so với cây thụ phấn trong tự nhiên.

Ví dụ: Strain1 và Strain2 là 2 dòng thuần, với tính trạng “hybrid vigour” được qui định bởi 2 genes A và B. Thì kiểu gene (genotype) của dòng thuần AA/bb hoặc aa/BB.

Đối với cây trồng, việc đa dạng kiểu gene đóng vai trò quan trọng. Vậy, đối với người thì như thế nào? Con người có chịu ảnh hưởng đối với một số tính trạng di truyền theo giới tính không? Ở phần 2 này, ta sẽ  tìm hiểu về các căn bệnh gặp phải ở trong phả hệ/nòi giống của một số gia tộc (pedigrees of families) đã cho thấy những ví dụ đầu tiên về sự di truyền (về bệnh tật) ở người, và chúng có liên quan đến giới tính.

  • Các di truyền lặn (recessive inheritance) được mô tả lần đầu đối với các rối loạn ancapton niệu (disorder alkaptonuria, 1902) hay chứng bạch tạng (albinism, 1903). Và các bệnh về di truyền trội như bệnh tay ngắn (brachydactyly, 1905), bệnh đục nhân mắt bẩm sinh (congential cataracts, 1906), chứng múa giật (Hungtinton’s chorea, 1913), sự loạn dưỡng ở cơ (Duchenne muscular dystrophy, 1913), bệnh mù màu xanh-đỏ (red-green color blindness, 1914), bệnh ưa chảy máu (hemophilia, 1916) là những căn bệnh di truyền liên quan đến giới tính (X-linked or sex-linked disorders).
  • Đồng thời người ta còn phát hiện ra rằng, một tính trạng không phải chỉ được qui định bởi duy nhất 1 gene (với tối đa 2 kiểu hình), vì có những tính trạng được qui định bởi nhiều genes (với nhiều hơn 2 kiểu hình, ví dụ: màu mắt nâu, xanh, đen, xám, …)

Từ xưa, việc hôn phối giữa những người cùng dòng tộc được xem là cách để bảo tồn nòi giống cao quí của mình. Vì thế, những căn bệnh mang tính di truyền liên quan đến giới tính cũng được truyền từ đời này sang đời khác. Ta hãy xem một ví dụ về dòng họ của Nữ hoàng Anh Victoria. Bà đã mang gene của căn bệnh ưa chảy máu (hemophilia), căn bệnh được xem là chỉ biểu hiện ở đàn ông.

  • Vòng tròn: đại diện cho nữ
  • Hình vuông: đại diện cho nam
  • Gạch nối ngang: quan hệ vợ chồng
  • Gạch nối đứng: quan hệ bố mẹ/con cái
  • Hình vuông tô đen: người bị ảnh hưởng bởi bệnh (affected male)
  • Hình tròn có chấm đen: có mang gene của bệnh, nhưng bản thân không bị bệnh (carrier female)

Cặp Albert-Victoria có 1 người con trai tên Leopold mang bệnh, 2 người con gái (Alice, Beatrice) được xem là có mang gene gây bệnh, vì con của họ có xuất hiện bệnh. Cháu gái của họ, Alexandra do có mang mầm bệnh, nên khi cưới sa hoàng (tsar) Nicholas đệ Nhị, đã có con trai tên Alexei bị bệnh.

  • Bệnh ưa chảy máu do 1 gene trên chromosome X qui định (kí hiệu: allele lặn gây bệnh là h, allele trội không gây bệnh là H)

Tiếp đến là ví dụ về màu mắt – tính trạng được qui định bởi hơn 1 gene: Charles Davenport, thiết lập Eugenics Record Office (ERO) năm 1910 nhằm tìm hiểu ứng dụng của di truyền giúp cho cuộc sống con người tốt hơn, đã có những nghiên cứu đầu tiên về di truyền của màu mắt. Họ tin rằng mọi tính trạng (trait) của con người đều di truyền theo qui luật di truyền về gene của Mendel. Tính trạng trội của màu mắt thường được xem là màu đen.

  • Một phụ nữ mắt nâu mà dòng họ từ nhiều đời có màu mắt nâu, nên có thể xem cô ấy có gene biểu hiện màu mắt là đồng nhất (homozygous). Cô cưới một người đàn ông có màu mắt xanh, cũng có gene biểu hiện màu mắt là đồng nhất.

Con cái của họ đều có màu mắt nâu, vậy màu nâu là màu mắt trội. Tỉ lệ màu mắt brown:blue ở F2 là 3:1, tuân theo tỉ lệ trội : lặn của Mendel. Điều này có vẻ hợp lí. Song, trên thực tế, các nhà khoa học ngày nay chứng tỏ được rằng màu mắt được qui định bởi 2 hoặc 3 genes . Do đó, các cố gắng để giải thích màu mắt là di truyền bởi hệ thống 1 gene đơn lẻ là không thuyết phục. Cụ thể qua sự chênh lệch về màu sắc với các mức độ khác nhau; đó được hiểu là do kết quả của sự biến đổi biểu hiện của các gene (gene expression) qui định tính trạng màu mắt ở từng cá nhân cụ thể.

Một ví dụ khác về căn bệnh di truyền ít nguy hiểm là ancapton niệu do Archibald Garrod phát hiện:

  • John bị bệnh và bà ngoại cậu ta bị bệnh
  • Bà ngoại của cậu có một người em trai cũng bị bệnh, và người em trai này là bố của mẹ John. Vậy mẹ của John và bố của John là anh em cậu gì (cùng huyết thống, cùng dòng máu – consanguineous), trong quan hệ gia phả, nó được biểu diễn bởi gạch ngang đôi

Cả bố và mẹ của John đều không mắc bệnh này, có nghĩa là họ đều mang gene gây bệnh capton niệu không đồng nhất (với 1 allele trội, 1 allele lặn, và cặp allele lặn đã được truyền cho John). Archibald Garrod cho rằng các bệnh di truyền lặn thường biểu hiện ra bên ngoài trong các gia đình có quan hệ huyết thống (consaguineous relationship)

TERM:

  • inbred: lai cùng dòng
  • outbred: giao phối xa
  • heterosis: ưu thế giống lai

SUMMARY:

Đối với cây trồng, việc tạo ra cây lai đóng vai trò cực kì quan trọng. Đây cũng là một phần trong sự tiến hoá của từng chủng loài khi mà sự đa dạng về di truyền đóng vai trò sống còn với mỗi chủng loài. Qua các thông tin đã thu thập được ở các phần, ta có thể nói rằng di truyền của Mendel không lí giải đầy đủ sức khỏe và tính cách của con người. Tính cách của con người rất phức tạp, hay các bệnh về tâm thần (mental illness), chúng được qui định bởi rất nhiều gene, và còn do các yếu tố khác như môi trường chính trị xã hội bên ngoài cấu thành, chứ không đơn thuần là yếu tố di truyền.

LINK:

  1. http://www.mendelweb.org/MWpaul.html#s6 (Bài viết của Mendel về sự ra đời của cây ngô lai)
  2. http://www.dnaftb.org/dnaftb/concept_12/con12bio.html
  3. http://www.genome.gov/27026388 (Chương trình chữa trị các chứng bệnh về di truyền chưa được biết đến của NIH)
  4. http://www.hhmi.org/genetictrail/